红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定 本文关键词：病菌，果实，鉴定，分离，炭疽病
红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定 本文简介：红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定 摘要：采集具有炭疽病症状的红富士果实样品进行组织分离、培养，获得苹果炭疽病菌株（编号为Acg1），采用形态学、分子生物学相结合的方法对其进行鉴定。根据分离菌株的菌落、分生孢子形态特征、rDNA-ITS序列分析将分离到的Acg1菌株鉴定为胶孢炭疽菌（Coll
红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定 本文内容：
红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定
摘要：采集具有炭疽病症状的红富士果实样品进行组织分离、培养，获得苹果炭疽病菌株（编号为Acg1），采用形态学、分子生物学相结合的方法对其进行鉴定。根据分离菌株的菌落、分生孢子形态特征、rDNA-ITS序列分析将分离到的Acg1菌株鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。
关键词：苹果；炭疽病菌；分离；鉴定；胶孢炭疽菌
我国是世界苹果生产第一大国[1]，红富士是从普通富士的芽变中选育出的着色系的统称，病害是制约苹果产业发展的重要因子。李保华等针对苹果病害管理中存在的问题进行分析并对苹果病害方面的研究进展进行综述[2]。炭疽菌属（Colletotrichum）是一类重要的植物病原真菌，可引起果实和叶子发生炭疽病害，并广泛分布于热带、亚热带地区[3]。近年来，炭疽菌属分类研究一直是国内外研究热点，并且分子生物学技术广泛应用于炭疽菌的分类研究[4-7]。研究表明，胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是苹果生长期和贮藏期的主要侵染性病害，是造成产量和品质损失的主要原因之一[8-10]。本研究从疑似炭疽病的红富士发病果实上采用组织分离法获得炭疽病源菌株，并采用rDNA-ITS序列分析和形态学相结合的方法对其进行鉴定，为苹果炭疽病害的生物防控提供依据并奠定基础。
1材料与方法
1.1样品采集
具有炭疽病症状的红富士果实样品采自山东省果树研究所天平湖基地红富士苹果园。
1.2病原菌的分离及形态特征观察
采用组织分离法。先用70%乙醇表面消毒具有炭疽病症状的红富士苹果样品，再用灭菌的解剖刀在病健交界处切下3 mm×5 mm的组织块，用70%乙醇消毒1 min，再用01%氯化汞处理40 s，最后用无菌水冲洗干净后置于PDA培养基上，25 ℃下暗培养3 d，挑取单个菌落菌丝，转移到新的PDA平板培养基上，25 ℃下暗培养6 d，保存得到的纯菌株，观察并记录菌落形态学特征，挑取分生孢子进行显微形态观测并记录孢子的形状大小。
1.3DNA提取和PCR扩增
真菌总DNA提取采用OMEGA公司试剂盒，提取的DNA溶解后于-20 ℃贮存备用。以菌丝总DNA为模板，对ITS区进行扩增，以ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）[11]、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]为引物（由上海铂尚生物技术有限公司合成）。
25 μL PCR反应体系：2.5 μL 10×PCR buffer（2.50 mmol/L，含Mg2+）、2.00 μL dNTPs（2.50 mmol/L）、050 μL ITS1（10.00 μmol/L）、0.50 μL ITS4（10.0 μmol/L）、0.75 μL DNA模板、0.25 μL（5.00 U/μL）Taq酶、18.50 μL灭菌水。
PCR扩增反应在BIO-RAD S1000TM PCR扩增仪上进行。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。
PCR产物由1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收纯化后与pMD 18-T载体连接，转化感受态细胞（大肠杆菌DH5α），挑取阳性克隆送上海铂尚生物技术有限公司进行测序。
1.4序列分析及构建系统进化树
所得序列在国际核酸数据库（http：//www.csmayi.cn/
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