新生儿糖尿病基因纯合突变分析 本文关键词：新生儿，突变，基因，糖尿病，分析
新生儿糖尿病基因纯合突变分析 本文简介：【摘要】新生儿枫糖尿病(MSUD)是由于支链α-酮酸脱氢酶(BCKD)复合体遗传性缺陷导致的支链氨基酸代谢障碍的疾病。在我国发病率低，早期诊断困难，预后差。本文介绍了1例MSUD患儿的临床资料，结合颅脑磁共振、磁共振频谱、血串联质谱分析、基因测序检测予以确诊，发现了BCKDHB基因的一个纯合突变：c
新生儿糖尿病基因纯合突变分析 本文内容：
【摘要】新生儿枫糖尿病(MSUD)是由于支链α-酮酸脱氢酶(BCKD)复合体遗传性缺陷导致的支链氨基酸代谢障碍的疾病。在我国发病率低，早期诊断困难，预后差。本文介绍了1例MSUD患儿的临床资料，结合颅脑磁共振、磁共振频谱、血串联质谱分析、基因测序检测予以确诊，发现了BCKDHB基因的一个纯合突变：c.254T>C(p.Leu85Ser)，是该病的致病性突变，且为此前未见报道过的突变。并结合相关文献复习，以期为新生儿MSUD的早期诊断及治疗提供借鉴。
【关键词】枫糖尿病；BCKDHB基因；DNA突变分析；磁共振波谱学枫糖尿病(maplesyrupurinedisease，MSUD)是由于支链α-酮酸脱氢酶(branchedchainalpha-ketoaciddehydrogenase，BCKD)复合体遗传性缺陷导致的支链氨基酸(branchedchainaminoacids，BCAA)代谢障碍的疾病。BCAA转氨过程中，其支链α-酮酸(branchedchainalpha-ketoacid，BCKA)不能脱羧，导致组织中BCAA和BCKA含量增高[1]。本文分析1例新生儿MSUD的临床资料，并检测颅脑磁共振频谱(MRS)，通过基因测序分析，明确了该患儿发病的分子遗传学证据。
1病例简介
患儿男，出生后1d，患儿因“出生后呕吐20h”入院。患儿系G4P3，胎龄36+6周，单胎顺产，出生体质量3000g，胎膜早破72h，脐带绕颈1周，否认羊水污染，Apgar评分9～10分。出生后2h开奶，5ml/次，1次/2h，出生后8h喂奶后出现呕吐，呕吐物初为白色奶渣，后呕吐褐色液，非喷射性，无黄绿色胆汁，每次进食后均有呕吐，多为褐色液，量少，一次呕吐为血性胃内容物，无发热，无少哭、少动，无气促、发绀，胎便已解，量不详，为墨绿色糊样便，无黏液血丝，予“洗胃、维生素K1”等治疗，禁食下无呕吐。查体：体温36.8℃，脉搏120次/min，呼吸45次/min，经皮血氧饱和度90%～95%。反应差，浅昏迷状态，皮肤略干燥，隐约可见花纹，无黄疸，前囟平，呼吸不规则，伴鼾鸣声，有呼吸费力，吸气相三凹征(+)，双肺呼吸音稍粗，可闻及痰鸣音，腹部稍膨隆，四肢肌张力减低，原始反射未引出。患儿父亲37岁，无业，母亲36岁，无业，非近亲结婚。父母均否认家族史及遗传疾病史。患儿有一位15岁哥哥，体健；患儿二哥出生后15d死亡，具体死因不详。
完善相关实验室检查，血常规、C反应蛋白及肝肾功能检测未见异常，血气分析示代谢性酸中毒，给予气管插管、机械通气呼吸支持，予纠酸对症治疗，禁食、限液。患儿入院后出现频繁惊厥，表现为四肢强直-阵挛、牙关紧闭、流口水，机械通气下无发绀，每次持续约半分钟后自行缓解，给予呋塞米降颅压对症治疗。结合患儿病史，考虑遗传代谢性疾病可能性大。检测颅脑MRI(见图1)示：双侧半卵圆中心、双侧基底核区、苍白球、内囊后肢、丘脑、脑干、大小脑脚、小脑齿状核呈对称性的异常信号改变，T1WI呈等低信号，T2WI呈等高信号，弥散加权成像序列(diffusionweightimaging，DWI)呈明显高信号；对应的表观扩散系数(apparentdiffusioncoefficient，ADC)图呈低信号，其ADC值较低；脑室、脑池系统形态、大小及位置未见异常改变；脑沟未见增宽；中线结构居中。颅脑MRS(见图2)：在MRS0.9ppm处可见一相对特异的宽峰，另外其MRS还表现为位于2.02ppm处的氮乙酰天门氨酸(Nacetylaspartate，NAA)峰的降低及1.33ppm处的乳酸(lacticacid，LAC)峰的升高，由于本MRS扫描使用的为长回波时间，故其波峰倒置。患儿入院后查血串联质谱结果提示亮氨酸(Leu)3024.23μmol/L、缬氨酸573.28μmol/L，均显著增高；尿气相色谱-质谱提示：2-羧基异戊酸、2-酮-异戊酸、2-酮-3甲基戊酸、2-酮-异己酸均增高；均符合MSUD诊断。及时给予禁食、B族维生素及左旋肉碱进行治疗，并抽取患儿外周血进行基因检测。
经过患儿父母同意后，采集患儿外周血2ml，抗凝处理后送杭州金域医学检验所行基因检测。通过对MSUD相关的4个基因外显子编码区进行直接基因测序，与参考序列作比对，4个基因的NCBI参考序列/分别为(BCKDHA：NM-000709.3与NC-000019.9；BCKDHB：NM-000056.3与NC-000006.11；DBT：NM-001918.2与NC-000001.10；DLD：NG-008045.1与NM-000108.4)。检测结果显示，检测到BCKDHB基因的一个纯合突变：c.254T>C(p.Leu85Ser)(见图3)；未检测到BCKDHA、DBT、DLD基因外显子编码区的致病性突变。该突变为错义突变，翻译产物蛋白质第85位氨基酸由Leu变为丝氨酸，该突变未见相关文献报道，在ESP6500、dbSNP、千人基因组数据库和HGMD数据库里均未见报道。同时，经初步生物信息学分析(LRT、PolyPhenomenon-2)，显示Leu85位点在进化上保守，可能致病。由于患儿父母拒绝进一步检测，未能获得患儿父母的DNA样本进行比对。
2讨论
MSUD是一种常染色体隐性遗传的氨基酸代谢性疾病，MENKES等[2]于1954年报道了第1例MSUD，因患儿尿液中有特殊的枫糖气味而得名。在人体中主要BCAA有Leu、异亮氨酸和缬氨酸。世界范围内MSUD发病率约为1/185000[3]，在一些特殊种族，如美国宾夕法尼亚州的门诺派教徒，由于该种群广泛存在的BCKDHA基因1312位T>A突变，新生儿MSUD的发病率高达1/358[4]。我国目前缺乏新生儿MSUD的确切发病率，以“枫糖尿病、新生儿”为检索词，检索万方数据知识服务平台，1996年至今，共检索出22例。MSUD主要临床表现有抽搐、酮症酸中毒、窒息、低血糖、昏迷、共济失调、精神运动迟缓、智力发育迟缓、髓鞘形成减少或脱髓鞘[5]。根据BCKD活性，MSUD分为5型：经典型、间歇型、中间型、维生素B反应型和二氢脂酰脱氢酶(E3)缺乏型。酶活性依次为正常人的0%～2%、2%～40%、5%～25%、20%～40%和5%～10%。其中，经典型起病急，预后极差，患儿出生时常无异常，但很快出现喂养困难、呕吐，并迅速发展为呼吸暂停、昏迷以致死亡。本例患儿以呕吐为起始症状，很快出现惊厥、四肢强直-阵挛等脑损伤表现，故考虑为经典型，但由于条件限制，未能测定患儿BCKD活性。
MSUD影像学检查有其特征性，由于MSUD患儿BCAA及其酮酸衍生物选择性损伤髓鞘，导致细胞毒性水肿及髓鞘间水肿。颅脑CT检查对脱髓鞘病变的灵敏度不高，而MRI对于MSUD的诊断有其特征性。正常足月新生儿大脑半球中央前后回、放射冠、半卵圆中心、内囊后肢、丘脑腹外侧核、大脑脚、脑干背侧、皮质脊髓束、脑桥、双侧小脑中脚及小脑白质等区域已经髓鞘化，在T1WI序列，上述部位正常情况应该为高信号。本例患儿在T1WI序列上，上述部位高信号消失，局部呈对称性低信号；本例患儿在T2WI序列可见上述部位呈对称性高信号，考虑为血管源性水肿表现；且DWI病变范围显示更加清晰，在上述部位对称性高信号，ADC图低信号，这是特征性的MSUD患儿的颅脑MRI表现，进一步帮助确诊MSUD。
MRS在MSUD的应用目前文献报道较少，表现为NAA水平下降，0.9～1.0ppm处异常升高的BCAA、BCKA及LAC峰，后期NAA水平可正常，LAC峰可消失，而BCAA峰可保持[6]。本例患儿有特征性的MRS表现：由于MSUD氧化脱羧作用异常造成其BCAA和BCKA上甲基质子聚集而在MRS0.9ppm处可见一相对特异的宽峰，另外其MRS还表现为位于2.02ppm处的NAA峰的降低及1.33ppm处的LAC峰的升高，由于本MRS扫描使用的为长回波时间，故其波峰倒置。由于氨基酸代谢异常造成髓磷脂蛋白的降解，因此容易累积脑髓鞘发育成熟快速区域，因此，在MSUD失代偿期，MRI及MRS检查可以作为疾病预后的评估方法[7]。
目前研究发现4种基因与MSUD有关，分别为BCKDHA、BCKDHB、DBT和DLD，4种基因的突变均是以微小突变为主，大多数可以通过直接基因检测发现。迄今为止，在这4种基因上探测到至少有156种突变类型，尤其以BCKDHB多见。本例患儿检测到BCKDHB基因的一个纯合突变：c.254T>C(p.Leu85Ser)，未检测到BCKDHA、DBT、DLD基因外显子编码区的致病性突变。该突变为错义突变，翻译产物蛋白质第85位氨基酸由Leu变为丝氨酸。不同类型的突变多与种族背景有关，但是目前关于亚洲人群尤其是中国人群的报道很少。2012年上海儿科研究所YANG等[8]报道了15例MSUD患儿，基因检测发现20种不同类型基因突变。本例患儿基因突变型与其相比较并未发现重复。且该突变未在ESP6500、dbSNP、千人基因组数据库和HGMD数据库里发现报道。表明这是1例新发现的BCKDHB基因突变。生物信息学分析显示，由于该基因突变c.254T>C突变，导致翻译产物蛋白质第85位氨基酸由Leu变为丝氨酸，且Leu85位点在进化上较保守，因而认为可能致病。BCKDHB基因突变的患儿父母多带有相同的基因位点突变，该患儿为纯合突变，遗传的可能性更高。但遗憾的是，由于该例患儿预后较差，未能获得患儿父母的基因样本进行参照。
MSUD一经诊断，需要早期治疗，可改善其预后。该病的治疗需要给予不含BCAA的特殊奶粉，监测血氨基酸水平，适当补充母乳，以防止氨基酸缺乏[9]。临床上对于所有MSUD患儿应试用维生素B1。对于BCAA大量堆积，急性代谢失代偿时可行持续血液透析。经典型MSUD最佳治疗时机是出生后7d以内，经过早期治疗1/3的患儿智力评分可达正常；超过14d开始治疗者预后较差。经过及时治疗的MSUD患儿，多可获得较好的预后，甚至有成年后能成功妊娠的报道[10]。STRAUSS等[11]报道利用选择性肝移植成功治疗11例经典型MSUD，使得无需限制氨基酸饮食以及避免了急性代谢失代偿的发生。目前肝移植在MSUD中的应用已越来越多，且疗效确切满意[12-14]。但在国内，MSUD的治疗欠满意。陈正等[15]统计了1996—2010年我国报道的共15例新生儿MSUD，有11例患儿放弃治疗或死亡，1例遗留脑性瘫痪，1例智力发育迟缓，仅2例好转出院。究其原因，主要还是未能及时诊断，且由于我国的优生优育政策，许多MSUD患儿家长选择了放弃治疗。本例患儿经机械通气、利尿、降颅压等对症治疗后，惊厥有缓解，但仍一直处于昏迷状态，后家属放弃治疗出院。经随访，出院后2d患儿死亡。
MSUD是致死、致残的遗传性疾病，提高医务人员及家长对MSUD的认识、对新生儿进行血串联质谱筛查、早期诊断、早期饮食及治疗干预可改善患儿预后。本文为今后进一步研究MSUD患儿临床基因分型提供了宝贵的基础，同时也对疾病的早期诊断和胎儿的产前诊断提供了帮助。
作者：黄玉梅 麦菁芸 杨祖钦 陈尚勤
《新生儿糖尿病基因纯合突变分析》
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