篇一：纳豆激酶发酵培养基的优化
纳豆激酶发酵培养基的优化
姓名: 黄江坤
班级：制药132
学号： 201304040225
纳豆激酶发酵培养基的优化
一、菌种选择
选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种
二、纳豆菌的特性
纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。孢子耐热性强。
三、纳豆激酶基因的表达
NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。蛋白前体切除N端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。
四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：
纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。40℃保温30mni活力无变化,温度超过50℃,
活力逐渐丧失,超过60℃时则因蛋白变性而迅速失活,反复融冻对酶活影响不大。
五、 以普通发酵培养基为基础培养基，分别改变培养基的组成和含量考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响
1氮源
纳豆激酶是种诱导酶，菌株分泌纳豆激酶的目的是利用它水解环境中的蛋白质及肽类,以提供自身生长所需的氨基酸。通过比较大豆蛋白胨、豆渣、豆浆和胰蛋白胨对产酶的影响,结果发现大豆蛋白胨最佳,豆渣和豆浆次之,而胰蛋白胨几乎不产纳豆激酶。而且还发现在大豆蛋白胨中存在诱导菌体分泌纳豆激酶的前体。
2碳源
目前在碳源优化研究中,已考察的碳源包括木糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉,一般结论是木糖为最优。其中,用葡萄糖作碳源时菌株产酶比较快,但产酶不多。这可能是葡萄糖代谢阻遏造成的,也可能与纳豆激酶表达启动子的性质有关。
3发酵液pH
发酵液的pH会影响菌体对基质的利用速度、细胞形态结构及细胞内外各种酶的活性,从而影响菌体的生长和产物的合成。各种菌株都有自己适宜的生长和产物合成的pH范围,而且这两者间还可能不同,因此要把发酵液pH值控制在需要的范围内。而在发酵过程中,随着碳源的利用,发酵液pH有下降的趋势;同时胰蛋白胨被水解生成铵离子又会使pH上升,因此需要加入缓冲体系以控制发酵液pH。所以选用NaH2PO4—Na2HPO4缓冲体系,除了这种体系简单易得,缓冲能力适宜外,还考虑到磷是核酸和蛋白质的必要成分,也是重要的能量传递者一三磷酸腺普(ATP)的成分;而且磷有利于糖代谢的进行,能促进微生物的生长繁殖。但研究中发现过量的磷也会抑制许多产物的合成。
4无机盐离子
镁离子是许多重要酶的激活剂,还能影响蛋白质的合成;同时镁离子对纳豆激酶稳定性有利。而硫是含硫氨基酸的组成部分,纳豆激酶恰好具有含硫氨基酸。因此在培养基中加入了一定量的MgSO。钙离子对纳豆激酶也有促进酶活稳定的
作用,所以还加入了CaCl2。但应该注意的是,MgHPO4和CaHPO4都是难溶物质。因此在配制培养基时应注意各组份添加顺序,避免产生沉淀、影响缓冲体系的缓冲能力。在本研究配制培养基时,先取水溶解胰蛋白陈和木糖,然后加入NaH2PO4，Na2HPO4,最后边搅拌边加入MgSO和GaC12,较好的避免了沉淀的产生。 5酶稳定剂
当与血清蛋白、胃粘液蛋白以及煮沸过的小麦或大米提取液和肉汤混合后,纳豆激酶的稳定性显著增加,甚至在酸性条件下,酶活性也不会完全丧失。这说明纳豆激酶在胃环境中能保持一定的活性,可食用纳豆达到溶栓目的。还有研究发现,K+、Fe2+对酶稳定性无明显影响,而Zn2+、Co2+、A13+、Ca2+和Mn2+等则表现出不同程度的抑制作用,Hg2+可使纳豆激酶完全失活,Mg2+和Co2+对酶有明显激活作用。
因此，可以选用大豆蛋白胨为氮源，木糖为碳源，NaH2PO4—Na2HPO4 MgSO CaCl2 为无机离子，煮沸的小麦提取液为酶稳定剂在pH在7—8条件下对基础培养基进行优化来获得优化的纳豆激酶发酵培养基。
青霉素发酵培养基的优化
姓名: 王俊
班级：制药131
学号： 201304040130
篇二：固体发酵纳豆激酶培养基的优化
固体发酵纳豆激酶培养基的优化
摘 要: 研究蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠 3 种培养基对固体发酵纳豆激酶的影响, 发现添加蔗糖和谷氨酸钠能提高
纳豆激酶酶活, 而添加葡萄糖反而抑制酶活。优化后的培养基为: 4%蔗糖、0%葡萄糖、2%谷氨酸钠。
关键词: 纳豆激酶; 固体发酵; 蔗糖; 葡萄糖; 谷氨酸钠
纳豆激酶(nattokinase)是一种枯草杆菌蛋白激
酶, 是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一
种丝氨酸蛋白酶, 1987 年由日本的须见洋行等首先
发现并命名的, 它是纳豆菌在发酵大豆时向胞外分
泌的一种易溶于水的碱性蛋白酶
[1]
。
近年来专家对纳豆激酶的结构、酶的活性部位
以及酶学性质的研究比较多, 纳豆激酶是由 275 个
氨基酸残基组成的一条单链多肽, 准确分子量为
27728, 等电点为 8.6±0.3, 敏感作用底物是纤维蛋
白。酶学性质研究表明纳豆激酶在 pH 6~12, 50 ℃
以下均较稳定
[2]
。
由于纳豆激酶是由纳豆菌发酵得到的, 可以大
规模生产, 而且在日本已经有上千年食用的历史, 所
以纳豆激酶是一种安全的理想的预防和治疗栓塞的
生化药物。
目前研究的纳豆激酶包括液体深层发酵和固体
发酵两种来源。有关液体发酵培养基优化方面的研
究已经很多, 本文主要研究在固体发酵条件下, 添加
蔗糖、葡萄糖和谷氨酸钠对纳豆产酶的影响。
1 材料
纳豆菌: 从日本纳豆中分离纯化所得, 实验室保
藏; 平板分离培养基: 酵母粉: 2%, 麦芽糖 0.5%, 氯
化钠 0.5%, 琼脂粉 2%, 121 ℃灭菌 20 min; 试管斜
面培养基: 肉汤固体培养基; 液体种子培养基: 酵母
粉: 2%, 麦芽糖 0.5%, 氯化钠 0.5% , 121 ℃灭菌 20
min。琼脂糖、纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶标准品, 中
国药品生物制品检定所;
蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠均为市售。
2 方法
2.1 种子培养
从斜面接一杯种子到 50 mL 液体培养基中, 37
℃摇床 150 r/min 培养 16 h。
2.2 固体发酵工艺
[3]
精选优质东北大豆洗净, 直径在 5.7~6.3 mm 之
间, 浸泡 10 h, 按要求添加各种浓度的培养基, 121℃
高压灭菌 30 min, 自然冷却到 70 ℃左右, 4%接种量
接上液体种子, 置生化培养箱中 37 ℃培养 24 h, 待
用。
2.3 纤维蛋白平板法测纳豆激酶活性
[4,5]
用 PBS (pH 7.4) 溶液将标准尿激酶配制成 5、
10、15、20、25 IU/mL 5 个浓度梯度, 将这 5 个浓度的
尿激酶溶液用微量进样器注入平板孔内, 10 !L/孔,
37 ℃培养 18 h, 游标卡尺测量每个溶圈的垂直直
径, 计算溶圈面积, 以尿激酶活力单位数为横坐标,
溶圈面积为纵坐标, 绘制标准曲线。根据提取的纳豆
激酶溶圈面积的大小, 在标准曲线上找出相当于尿
激酶的活力单位数。
2.4 从新鲜纳豆中提取纳豆激酶
在每瓶新鲜发酵的纳豆中, 加入 200 mL 生理
盐水浸取 1 h, 然后 3 000 r/min 离心 10 min, 取上清
液, 稀释一定的倍数, 采用 2.3 方法测定酶活。
3 结果
3.1 尿激酶标准曲线
尿激酶浓度和对应溶圈面积见表 1、图 1。
表 1 尿激酶浓度和对应溶圈面积
尿激酶浓度/(IU·mL
-1
) 5 10 15 20 25
溶圈面积/mm
2
116 153 174 199 225
从图 1 可以看出, 尿激酶活力与溶圈面积基本
上成直线关系, 其直线方程为: y = 5.28x + 94.2, 用
此方程可以计算出纳豆激酶的纤溶活性。
收稿日期: 2007- 11- 20
作者简介: 李永飞(1976- ),女,工程师, 专业方向: 生物和食品工程。
582008 年第33 卷第1 期粮 食 加 工
图 1 尿激酶活力与溶圈面积的关系
3.2 蔗糖对纳豆激酶的影响
称取浸泡后的湿豆子 8 瓶, 每瓶 100 g, 分别加
入 1%葡萄糖和 0.5%谷氨酸钠, 分成 4 组, 分别加入
质量分数为 0%、2%、4%、6%的蔗糖, 把培养基摇匀
后, 置 121℃灭菌 30 min, 冷却至 70 ℃左右, 接入
4%液体种子, 摇匀, 置 37 ℃培养箱培养 24 h 。
采用 2.3、2.4 的方法浸取纳豆激酶并测定其酶
活, 分别取平均值。见图 2。
图 2 蔗糖对纳豆酶活的影响
从图 2 可以看出, 在低浓度下, 随着加入的蔗糖
质量分数越高, 纳豆激酶酶活越高, 蔗糖有利于促进
纳豆产酶, 添加 4%与 6%纳豆产酶一样, 最终确定
蔗糖的添加量为 4%。
3.3 葡萄糖对纳豆激酶的影响
称取浸泡后的湿豆子 8 瓶, 每瓶 100 g, 分别加
入 2%蔗糖和 0.5%谷氨酸钠, 分成 4 组, 分别加入质
量分数为 0%、1%、2%、3%的葡萄糖, 把培养基摇匀
后, 置 121 ℃灭菌 30 min, 冷却至 70 ℃左右, 接入
4%液体种子, 摇匀, 置 37 ℃培养箱培养 24 h 。
采用 2.3、2.4 的方法浸取纳豆激酶并测定其酶
活, 分别取平均值。见图 3。
图 3 葡萄糖对纳豆酶活的影响
从图 3 可以看出, 添加葡萄糖反而不利于纳豆
产酶, 当葡萄糖质量分数为 0%时, 纳豆激酶活力最
高, 达 500 IU/g 新鲜纳豆。
3.4 谷氨酸钠对纳豆激酶的影响
称取浸泡后的湿豆子 8 瓶, 每瓶 100 g, 分别加
入 2%蔗糖和 1%葡萄糖, 分成 4 组, 分别加入质量
分数 0%、0.5%、1%、1.5%的谷氨酸钠, 把培养基摇
匀后, 置 121 ℃灭菌 30 min, 冷却至 70 ℃左右, 接入
4%液体种子, 摇匀, 置 37 ℃培养箱培养 24 h 。
采用 2.3、2.4 的方法浸取纳豆激酶并测定其酶
活, 分别取平均值。见图 4。
图 4 谷氨酸钠对纳豆酶活的影响
从图 4 可以看出, 谷氨酸钠能促进纳豆产酶, 而
且谷氨酸钠的质量分数越高, 纳豆激酶的酶活越高。
纳豆在发酵过程中除了分泌纳豆激酶以外, 还
分泌聚谷氨酸, 谷氨酸钠是聚谷氨酸的前提物质, 能
促进聚谷氨酸的合成。从发酵的纳豆可以看到, 谷氨
酸钠添加越多, 纳豆丝越长越韧, 说明纳豆分泌的聚
谷氨酸越多。谷氨酸对纳豆激酶的促进作用可能与
聚谷氨酸的形成有关。
3.5 各种培养基优化前后产酶的比较
优化前的培养基为: 2%蔗糖、1%葡萄糖、0.5%
谷氨酸钠, 最终发酵的纳豆激酶酶活为 250 IU/g 新
鲜纳豆, 1 g 干大豆能发酵成 2.2 g 新鲜纳豆, 折算
成每克干大豆能产酶 550 IU。
优化后的培养基: 4%蔗糖、0%葡萄糖、2%谷氨
酸钠, 最终发酵的纳豆激酶的酶活为 750 IU/g 新鲜
纳豆, 折算成每克干大豆能产酶 1 650 IU。
4 结论
(1) 在纳豆的固体发酵中, 适当添加培养基, 能
促进纳豆产酶, 比如蔗糖和谷氨酸钠, 确定最终添加
量分别为 4%和 2%;
(2)葡萄糖并不能促进纳豆产酶, 但是添加葡萄
糖后, 纳豆的氨味明显减弱, 适合在新鲜纳豆产品中
添加;
(3)通过对培养基优化, 使纳豆产酶提高 3 倍;
( 下转第 63 页)
592008 年第33 卷第1 期粮 食 加 工
Optimization of the Solid- state Fermentation Medium for Nattokinase
LI Yong- fei, WANG Zheng- gang, LU Ze- min, ZHOU Wang- yan
(National Science Park of Jiangnan University, Wuxi Jiangsu 214028, China)
Abstract: Effect of sucrose, glucose and sodium glutamine on solid- state fermentation for nattokinase were
studied. The result showed the additions of sucrose and sodium glutamine could enhance nattokinase activity and
glucose inhibit it .
Key words: nattokinase ; solid- state fermentation; sucrose glucose ; sodium glutamine
(4) 固体发酵的纳豆激酶存在的缺点是酶活纯
度不高, 纳豆菌含量高, 约 2.0×10
10
, 酶活分离提取
较困难, 得率低, 产品不适合做生化药物, 适合做保
健品配料, 因为纳豆发酵中除了纳豆激酶还有很多
活性物质, 比如大豆异黄酮活性提高、Vk 含量较高、
聚谷氨酸含量高, 与纳豆菌一起对肠道的调理效果
明显, 能治疗便秘。
参考文献:
[1] 王正刚, 丁贵平, 蔡正森. 纳豆激酶的溶栓作用研究[G]//全
国中西医结合周围血管疾病学术研讨会论文选编, 2001:
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食加工, 2007, 32(2) : 57- 59.
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基酸和生物资源, 2001, 23(20) : 17- 21.
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外溶栓作用[J]. 中国生化药物杂志, 1999, 20(3) : 148- 150.
Gluten Flour the Air Current Drying Bulb Studies
LIANG Ming- hai, ZHOU Quan- shen, QIAO Yong- qin, DU Zheng
(Machine & Electronics College of Henan Technology University, Zhengzhou 450052, China)
Abstract: The air current water extractor is gluten flour produces the widespread application drying appara-
tus. Because the process is complex, used formerly the design calculation method namely overall method of aver-
age and tries the method of difference, the former computed result error was big, the latter too complicated. This
article introduced one kind of use was mad - the solid two- phase flow related theory and the related heat transfer
research trial result, establishes the process mathematical model, carries on the partition to the air current drying
bulb, the district the gradually computational method, its computed result and the actual situation tally well, and
through analyzes its good and bad points to the ascending pipe and the pulse tube computed result, may use in
the engineering calculation.
Key words: gluten flour ; phase flow theory ; pulse air current dry ; drying bulb 3 结语
由实例计算知, 由气固两相流动理论对谷朊粉
气流干燥管进行的分段计算, 数值结果与实际情况
吻合较好。证明了本文提出的数学模型和计算方
法是可靠的, 该数学模型为谷朊粉气流干燥管的设
计和优化提供了理论依据。
参考文献:
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化学工业出版社,2005,(2) : 44- 70.
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业工程大学学报,1994,(2): 35- 42.
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( 上接第 59 页)
63
篇三：纳豆实验论文
纳豆芽孢杆菌的分离纯化及纳豆接种培养
黄颖敏 2013级生物工程1班 201330550107
摘要
实验通过从纳豆中稀释得到纳豆芽孢杆菌，通过稀释抹布平板法进行一系列的浓度梯度稀释，分离，镜检，培养等一系列的分离纯化过程，得到纳豆芽孢杆菌，取10?6、10?7、10?8这三种浓度的菌液进行培养，从而分析纳豆芽孢杆菌的生长情况。通过对黄豆进行蒸煮、冷却、接种、发酵等一系列操作制作纳豆产品。 关键词
分离纯化 稀释 纳豆芽孢杆菌纳豆制作
1、前言：
分离纯化和选择培养是在微生物的研究中经常用到的基本操作方法，通过本次实验让学生可以掌握微生物分离纯化的操作步骤，掌握微生物简单鉴定方法，同时了解微生物生长状况检测指标等。
2、材料：
2.1、材料与试剂：
黄豆（50g/组）、饭盒（带盖）、接种用纳豆产品、酱油、芥末、筷子、无菌水、灭菌试管、灭菌平皿、250ml三角瓶（带玻璃珠）、250ml三角瓶、100ml量筒、不锈钢锅、电磁炉、试管架、玻璃棒、电子天平、大塑料筐、称量纸、不锈钢大口盅、纱布、大漏勺、1ml枪头、移液枪、橡皮筋、牛皮纸（报纸）、试管塞、三角瓶塞、标签纸、pH试纸、酒精灯、洗瓶、吸水纸、废液缸、涂布棒、接种环、载玻片、10%NaOH、5%HCl、肉汤培养基、95%乙醇、蒸馏水、结晶紫染液、碘液、番红染液、香柏油、二甲苯、擦镜纸
2.2、仪器：
超净台、恒温培养箱、分光光度计、PH计、显微镜
3、方法：
3.1、固体发酵接种：
固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。从生物反应过程中的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点。
3.2、分离纯化：
研究微生物的基本方法，将某种特定微生物从群体或混杂的微生物群体分离出来的技术称为分离；通过高度稀释或划线方法使得在平板培养基上的某一区域仅存留一个单细胞，并使此单细胞增值成为一个新的群体，该群体称为单菌落，获得单一菌种，此过程即为纯化。
3.3、选择培养：
由于不同微生物生长条件和对营养要求不同，制备仅适合要分离的微生物生长繁殖的培养基，来培养混合微生物，改变群体中目的微生物的比列，达到分离目的。
4、过程：
4.1、实验前准备：
配置200ml肉汤培养基；制备无菌水20支（各装9ml）；将平皿灭菌。
4.2、实验流程：
纳豆芽孢杆菌分离纯化：样品稀释→倒平板→涂布→培养→观察菌落
纳豆芽孢杆菌观察（革兰氏染色）：样品稀释→涂片→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检
纳豆接种培养：黄豆→浸泡→蒸煮→冷却→接种→发酵→成品
4.3、实验步骤：
4.3.1样品稀释：
取纳豆成品10g，放入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡摇匀，将细胞分散。采用10倍稀释法，将菌悬液稀释至10、10、10、10、10、10、10、10不同浓度菌悬液。
4.3.2倒平板：
将已灭菌的肉汤培养基冷却至40℃~50℃（不烫手为止）倒入已灭菌的平皿中（大约-1-2-3-4-5-6-7-8
15~20ml）。
4.3.3涂布：
待平皿中的培养基冷却凝固后，用无菌吸管分别吸取10、10、10浓度菌悬液200?L滴在平板培养皿表面中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。
4.3.4培养：
置于37℃恒温培养箱中倒置培养2天。
4.3.5革兰氏染色：
初染：滴加结晶紫于已干燥固定的载玻片上，染色2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上的水甩干。
媒染：用碘液媒染1min，水洗。
脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20~30s），立即水洗，种植脱色，将载玻片上的水甩净。
复染：在涂片上滴加番红液复染2~3min，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色过程中，不可使染液干涸。
4.3.6镜检：
干燥后，用油镜观察。由于纳豆芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，理论上应被染成紫色。
4.3.7纳豆接%
《发酵与纳豆激酶的论文1500字》
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